RT-PCR試劑盒使用注意事項

　　RT-PCR試劑盒反應就是從RNA反轉錄至cDNA，然后通過PCR反應擴增cDNA的過程。試劑盒采用了一步反應法完成整個RT-PCR反應，即RNA-cDNA-PCR反應操作在同一反應體系中進行，反應過程中不需增加額外的步驟，就可完成整個RT-PCR反應，同時整個反應系統(tǒng)且含有電泳時所需要的試劑，可直接上樣電泳。本試劑盒具有方便、簡捷、靈敏度高、重復性好的特點，可適用于各種動、植物、病毒RNA的PCR檢測。

　　RT-PCR試劑盒備注：

　　1.用戶可根據(jù)自己的情況調(diào)整優(yōu)化PCR反應擴增參數(shù)：

　　·退火溫度：可根據(jù)實際情況適當?shù)靥岣呋蚪档屯嘶饻囟龋?0℃~65℃）。

　　·延伸時間：延伸時間因目的序列長度的不同而不同

　　·循環(huán)次數(shù)：cDNA量較少時，循環(huán)次數(shù)可增加為40~50次

　　·調(diào)整鎂離子的濃度

　　2.用戶可根據(jù)本試劑盒提供的β-actin引物（陽性對照）驗證RT-PCR體系是否良好（選做）：

　　1.使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；

　　2.取滅過菌且無核酸酶的0.2mlPCR管，依次加入。

　　RT-PCR試劑盒使用注意事項：

　　1.平臺效應：PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù)，均應通過單獨實驗來確定。

　　2.防止DNA的污染：①采用DNA酶處理RNA樣品；②在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

　　3.RNA提取試劑盒：目前試劑公司有多種RNA提取試劑盒、cDNA試劑盒、PCR試劑盒以及RT-PCR試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。如果使用試劑盒，具體操作步驟請參照試劑盒說明書。