分歧巴貝斯蟲探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒

儲(chǔ)存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
分歧巴貝斯蟲探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。相對(duì)于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測(cè)靈敏度。
二、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線（以10-10E6這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對(duì)照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2和1號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。
5. 換槍頭，從6號(hào)管中取5 μL溶液到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。
6. 換槍頭，從5號(hào)管中取5 μL溶液到4號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。
7. NC管中不加任何陽性對(duì)照。
8. 從1-6號(hào)管中分別取5 μL和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步），每個(gè)樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個(gè)陽性對(duì)照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應(yīng)用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DN段作為陽性對(duì)照。
2.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號(hào)管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 4 號(hào)管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20  μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產(chǎn)品：

格拉司瓊相關(guān)物質(zhì)D標(biāo)準(zhǔn)品兔超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)ELISA Kit，48T/96T

格拉司瓊相關(guān)物質(zhì)E標(biāo)準(zhǔn)品雞熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA Kit，48T/96T

葡萄籽低聚原花青素標(biāo)準(zhǔn)品人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA Kit，48T/96T

分歧巴貝斯蟲探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒純化葡萄籽低聚原花青素標(biāo)準(zhǔn)品小鼠熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA Kit，48T/96T

灰黃霉素標(biāo)準(zhǔn)品大鼠熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA Kit，48T/96T

滲透直徑測(cè)定用灰黃霉素標(biāo)準(zhǔn)品人熱休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)ELISA Kit，48T/96T

愈創(chuàng)木酚標(biāo)準(zhǔn)品小鼠熱休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)ELISA Kit，48T/96T

愈創(chuàng)木酚甘油醚標(biāo)準(zhǔn)品猴子熱休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)ELISA Kit，48T/96T

醋酸胍那芐標(biāo)準(zhǔn)品大鼠熱休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)ELISA Kit，48T/96T

鹽酸胍法辛標(biāo)準(zhǔn)品牛可溶性白細(xì)胞分化抗原86(B7-2/sCD86)ELISA Kit，48T/96T

鳥嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品人可溶性白細(xì)胞分化抗原86(B7-2/sCD86)ELISA Kit，48T/96T

純化香膠樹提取物標(biāo)準(zhǔn)品小鼠可溶性白細(xì)胞分化抗原86(B7-2/sCD86)ELISA Kit，48T/96T

孕二烯二酮 Z標(biāo)準(zhǔn)品大鼠可溶性白細(xì)胞分化抗原86(B7-2/sCD86)ELISA Kit，48T/96T

哈拉西泮標(biāo)準(zhǔn)品人缺血修飾白蛋白(IMA)ELISA Kit，48T/96T

氟舒松標(biāo)準(zhǔn)品小鼠缺血修飾白蛋白(IMA)ELISA Kit，48T/96T envelope glycoprotein (Yellow fever virus)  黃熱病包膜糖蛋白抗體馬來酸依那普利

envelope glycoprotein (Dengue virus type-2)  登革熱病抗體依那普利雙酮

ENTPD5/CD39L4  原癌基因CD39樣蛋白4抗體依那普利拉

ENTHD1/Epsin2B  Epsin2B蛋白抗體蘭索拉唑

Entactin/Nidogen  巢蛋白1抗體富馬酸比索洛爾

Ensconsin  上皮細(xì)胞微管相關(guān)蛋白7抗體馬來酸氨地平

ENPP7  堿性鞘脂酶7抗體苯羥胺

ENPP3/CD203c  ENPP3抗體IgG鹽酸苯環(huán)壬酯雜質(zhì)

ENPP2  核苷酸焦酸酶2抗體N-基-3-氮苯雙環(huán)（3，3，1）壬-9α醇

ENPP1  核苷酸內(nèi)焦酸酶/酸二酯酶1抗體鹽酸苯環(huán)壬酯

ENPP1  核苷酸內(nèi)焦酸酶/酸二酯酶1抗體非洛地平

ENO3  骨骼肌烯醇化酶抗體二氟尼柳

ENO1+ENO2+ENO3  神經(jīng)元，肌肉特異性烯醇化酶抗體羥苯酯鈉

ENO1  MYC啟動(dòng)子結(jié)合蛋白1抗體布洛芬雜質(zhì)C

Enkephalin/P-ENK  腦肽抗體2-（4-異酰苯基酸）布洛芬雜質(zhì)A）

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。